先兆子痫（PE）是一种妊娠特有的综合征，表现为妊娠20周或更晚期出现高血压、蛋白尿及多脏器功能障碍。全球约有2%-8%的妊娠伴随PE，这也是孕产妇及围产期发病和死亡的主要原因。目前尚无有效的预防或治疗方法。

 

PE被认为是胎盘源性疾病，因为只有胎盘去除后症状才能缓解，提示胎盘在PE发病机制中起核心作用。虽然氧化应激、滋养层细胞功能障碍及子宫螺旋动脉重塑受损被认为是PE的主要原因，但PE的确切病因和机制仍不明确。因此，识别胎盘中潜在的致病因素对于深入理解PE的发生和发展至关重要。

 

 

今年4月3日，南方医科大学南方医院妇产科钟梅团队在《Advanced Science》(IF=14.3)上在线发表了题为“Thrombospondin-1 Regulates Trophoblast Necroptosis via NEDD4-Mediated Ubiquitination of TAK1 in Preeclampsia”的最新研究成果^[1]。研究揭示了THBS1在妊娠期高血压综合症中的重要作用及其调控机制，为妊娠期高血压综合症的治疗提供了新的思路和潜在靶点。该文章第一作者为南方医科大学南方医院妇产科胡皓玥博士后，马菁博士，彭铕博士，冯日宣硕士；通讯作者为南方医科大学南方医院妇产科钟梅教授、香港中文大学妇产科学系黄志超教授与南方医科大学南方医院妇产科尹爱兰副主任医师。云顶国际为该研究提供了蛋白质组学技术检测。

 

 

 

研 究 思 路

 

 

 

研 究 结 果

 

1. 基于TMT定量蛋白质组学分析鉴定先兆子痫患者胎盘中的致病蛋白

为确认先兆子痫（PE）的致病蛋白，研究人员对七个胎盘样本（包括三例重度PE患者和四例正常孕妇）进行了TMT定量蛋白质组学分析，共鉴定出74个上调蛋白和66个下调蛋白（sPE/NP倍数变化>1.2或<0.83，p<0.05）。

 

GO和KEGG分析显示，这些差异蛋白参与了多种生物过程、细胞成分和分子功能，并与吞噬体及溶酶体通路相关。蛋白互作分析发现，GAPD、ALB、THBS1和LDHB等蛋白在网络中处于核心位置。THBS1是sPE患者胎盘中显著下调的蛋白之一，并且注释到的GO条目最多。因此，THBS1被选为本研究的主要研究对象。

 

图1 THBS1在重度先兆子痫胎盘中下调

 

2. THBS1缺乏导致滋养层细胞功能障碍

CCK8检测和EdU染色结果表明，THBS1敲低抑制了HTR8/SVneo细胞的活力和增殖。流式细胞术显示，THBS1敲低导致细胞周期停滞在G2/M期，S期和G0/G1期细胞比例下降，同时细胞凋亡率显著增加。Transwell实验结果表明，THBS1敲低显著抑制了细胞的迁移和侵袭能力。这些数据表明，THBS1在HTR8/SVneo细胞中发挥了关键的调控作用，对滋养层细胞功能具有重要影响。

 

图2 THBS1缺乏会导致滋养层细胞功能障碍

 

3. 抑制THBS1诱导滋养层细胞坏死性凋亡，但不诱导Caspase依赖性凋亡

为了探究THBS1在滋养细胞功能障碍中的调控机制，对其转录组进行RNA测序分析，鉴定出238个差异基因，其中128个为上调基因，110个为下调基因。KEGG分析显示，上调基因主要富集于TNF、NF-κB、Nod样受体和坏死性凋亡通路。

 

进一步研究发现，THBS1敲低显著上调了坏死性凋亡通路中关键分子RIPK1、p-RIPK3、RIPK3和p-MLKL的表达。同时，THBS1敲低还增强了DAMPs（如HMGB1、IL-1α和IL-33）的表达。KEGG分析和GSEA分析显示，THBS1敲低主要影响坏死性凋亡通路，而对细胞凋亡影响较小。THBS1敲低对凋亡标志物cleaved-caspase3的表达无显著影响。

 

使用Necrostatin-1（Nec-1）、GSK'872和Z-VAD-FMK（分别为RIPK1、RIPK3和pan-caspase的抑制剂）处理THBS1敲低的HTR8/SVneo细胞，发现Nec-1和GSK'872显著恢复了细胞活力和增殖，同时降低了细胞凋亡率；而Z-VAD-FMK未显著改善这些指标。蛋白组学分析表明，Nec-1和GSK'872显著降低了RIPK1、p-RIPK3、RIPK3、p-MLKL及DAMPs的表达，而Z-VAD-FMK处理组没有相关变化。这些结果表明，THBS1敲低引起的滋养细胞功能障碍主要是由于细胞坏死性凋亡。

 

图3 抑制THBS1诱导滋养层细胞坏死性凋亡，但不诱导Caspase依赖性凋亡

 

4. THBS1与滋养层细胞中的TAK1相互作用

通过RT-qPCR和Western Blot分析细胞坏死性凋亡的关键调节因子ZBP1和TAK1，发现THBS1敲低对TAK1的mRNA水平无显著影响，但显著降低了其蛋白水平，而THBS1过表达则显著上调TAK1的mRNA和蛋白水平。

 

为探究THBS1与TAK1的相互作用，Co-IP实验证实了HTR8/SVneo细胞中内源性THBS1与TAK1的结合，免疫荧光染色显示两者在细胞质中共定位。AlphaFold2结构预测显示，THBS1的N末端结构域与TAK1结合位点最多。

 

图4 THBS1与滋养层细胞中的TAK1相互作用

 

5. THBS1维持滋养层细胞中TAK1的稳定性

为了探究THBS1对TAK1稳定性的影响，研究人员使用CHX抑制蛋白质合成，并观察TAK1的稳定性。结果显示，THBS1沉默加速了TAK1的降解，而THBS1过表达则维持了TAK1的稳定。此外，THBS1敲低增加了TAK1的泛素化水平。这些数据表明，THBS1通过介导TAK1的泛素化来促使TAK1降解。

 

图5 THBS1维持滋养层细胞中TAK1的稳定性

 

6. THBS1敲低通过激活NEDD4介导的K48连接的TAK1泛素化使TAK1不稳定

接下来研究人员探究了THBS1如何介导TAK1的泛素化降解。RNA-seq结果显示，sh-THBS1组中E3泛素连接酶NEDD4显著升高。RT-qPCR和Western Blot实验表明，THBS1沉默或过表达分别导致NEDD4的mRNA和蛋白水平上调或下调，暗示THBS1敲低可能通过激活NEDD4影响TAK1的泛素化。

 

Co-IP实验证实NEDD4与TAK1在HTR8/SVneo细胞中相互结合，免疫荧光实验表明他们在细胞质中共定位。CHX处理实验表明，NEDD4过表达加速TAK1的降解，而NEDD4减少则减缓TAK1降解。利用HA标记的泛素载体实验发现，NEDD4增强TAK1与泛素的结合，特别是K48连接的泛素化，这通常与蛋白酶体降解途径有关。这些结果证实了NEDD4直接与TAK1相互作用，并催化TAK1的K48连接泛素化。此外，NEDD4缺失情况下，THBS1敲低导致的TAK1降解减少，表明THBS1敲低通过激活NEDD4介导的TAK1泛素化使TAK1不稳定。NEDD4敲低实验显示，其可以逆转THBS1沉默介导的细胞坏死和DAMPs相关蛋白的表达。

 

图6 THBS1敲低通过激活NEDD4介导的K48连接的TAK1泛素化使TAK1不稳定

 

7. 补充THBS1可改善妊娠小鼠的PE表型和胎盘坏死

研究人员通过皮下注射L-NAME建立了小鼠PE模型。THBS1在一定程度上改善了L-NAME引起的高血压和尿蛋白水平。与对照组相比，L-NAME显著降低了胎儿体重，而L-NAME+THBS1组的胎儿体重显著高于L-NAME组。此外，THBS1补充还逆转了L-NAME引起的胎盘血管生成不平衡。IHC分析显示，L-NAME组中THBS1和TAK1的表达下调，而THBS1补充后这些表达水平恢复正常；NEDD4的表达则与THBS1和TAK1相反。

 

图7 补充THBS1可改善妊娠小鼠的PE表型和胎盘坏死

 

 

 

研 究 结 论

 

THBS1下调通过NEDD8介导TAK1泛素化进而参与PE发病机制

THBS1下调引起NEDD4上调进而介导的K48连接的TAK1多泛素化使TAK1不稳定，从而诱导滋养细胞坏死性凋亡。

 

 

 

 

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参考文献：

Hu H, Ma J, Peng Y, Feng R, Luo C, Zhang M, Tao Z, Chen L, Zhang T, Chen W, Yin Q, Zhai J, Chen J, Yin A, Wang CC, Zhong M. Thrombospondin-1 Regulates Trophoblast Necroptosis via NEDD4-Mediated Ubiquitination of TAK1 in Preeclampsia[J]. Adv Sci (Weinh). 2024 Jun;11(21):e2309002.