发表期刊：Immunity

文章名称：Interleukin-34-orchestrated tumor-associated macrophage reprogramming is required for tumor immune escape driven by p53 inactivation

发表时间：2024年8月

影响因子：32.4

诺禾致源提供服务：10x Genomics Visium

研究总结：

作为癌症中最常见的基因突变，超过一半的人类癌症中存在导致转录失活的p53突变。然而p53如何调节免疫景观以形成一个有利于免疫逃逸的生态位仍然不清楚。中国科学技术大学魏海明团队在Immunity在线发表题为Interleukin-34-orchestrated tumor-associated macrophage reprogramming is required for tumor immune escape driven by p53 inactivation的研究论文，研究发现在p53失活的肝癌中，癌症干细胞（CSCs）建立了一个由白介素-34（IL-34）主导的生态位以促进肿瘤发生。机制上发现Il34是一个受到p53转录抑制的基因，p53的失活导致CSCs分泌IL-34。IL-34通过CD36介导的脂肪酸氧化代谢增加，驱动泡沫样肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的M2样极化。这些由IL-34主导的TAMs抑制了CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫，从而促进了免疫逃逸。阻断IL-34-CD36通路引发了抗肿瘤免疫，并与抗PD-1免疫疗法协同作用，最终导致完全缓解。该研究结果揭示了p53调节肿瘤免疫微环境的潜在机制，并为p53失活相关癌症的免疫疗法提供了一个潜在的靶点。本研究中10x visium空间转录组测序服务由诺禾致源提供。

TP53（编码p53蛋白）是人类癌症中突变最频繁的基因。大多数TP53突变发生在核心DNA结合域，使转录因子功能失活，p53功能的丧失被认为是多种肿瘤的驱动因素。作为一种转录因子，p53是一种序列特异性的DNA结合蛋白，直接启动包括CDKN1A和MDM2在内的大量基因的转录，同时也直接抑制许多其它基因的表达，如CPS1和NANOG。p53因其在诱导受压细胞的细胞周期停滞和凋亡中的作用，被称为“基因组的守护者”。在小鼠模型中，p53的重新激活被证明是一种强有力的癌症治疗方法，可以导致多种类型肿瘤的消退。值得注意的是，p53重新激活引起肿瘤消退需要免疫系统的参与。然而，目前关于p53调控TIME（肿瘤免疫微环境）的知识有限且分散。p53如何通过调控免疫景观来创造免疫逃逸环境仍需进一步研究。

研究成果一

IL-34 是 p53 失活驱动的肿瘤发生所必需的关键因子

为了研究 p53 如何调节肿瘤微环境（TIME），利用 CRISPR-Cas9 和转座子介导的基因编辑系统，生成了 p53 缺失型（Trp53^null）和 p53 野生型（Trp53^WT）自发性肝癌小鼠模型。通过 RNA-seq 分析发现 Il34 在 Trp53^null 肿瘤中的表达显著增加。这一发现通过 q-PCR、ELISA 和免疫印迹得到证实。此外研究还提取了原代肿瘤细胞培养物，并通过单核 RNA 测序（snRNA-seq）确定了 TIME 中分泌 IL-34 的细胞亚群。结果表明，在 Trp53^null肿瘤中，癌症干细胞（CSC）是主要的 IL-34 分泌细胞。为了进一步研究 IL-34 对 Trp53^null肝癌发展的影响，研究生成了 Il34^-/- 小鼠并注射 Trp53+Pten 或 Trp53+Myc 质粒以诱导自发性 Trp53^null 肝癌。结果显示，与 Il34^+/- 对照组相比，Il34^-/- 小鼠中未观察到 Trp53^null肝癌的肿瘤发生。这表明 IL-34 是 p53 失活驱动的肿瘤发生所需的关键因子。

研究成果二

p53功能丧失直接诱导IL-34分泌

研究表明在p53缺失的CT细胞和AML12细胞中，基因敲除Trp53导致p21表达无法在Nutlin-3处理后增加，同时IL-34表达显著上调。相反，p53在PT细胞中的过表达显著抑制IL-34转录。与此一致，TP53基因敲除在HepG2细胞中也导致IL-34表达增加。通过染色质免疫沉淀（ChIP）和高通量测序，我们发现p53直接结合到IL34和CDKN1A（p21）基因位点。进一步的ChIP-PCR等实验也证实了p53与IL34启动子的结合。为了验证p53对IL-34启动子转录活性的调控作用，实验构建了含有IL-34启动子的荧光素酶报告质粒，并与WT p53共转染293T细胞。结果显示，p53过表达导致荧光素酶活性显著下降，但与突变型p53（R249S或R175H）共转染时未观察到这种下降。启动子实验表明，p53调控活性依赖于IL-34启动子上的特定区域（-1200到-800）。共识p53结合位点（-858到-838）的突变消除了p53对荧光素酶活性的抑制作用。综上所述，p53通过直接结合IL-34启动子抑制其转录，p53缺失或突变会导致这种调控作用的丧失。

研究成果三

IL-34 诱导的促肿瘤泡沫状巨噬细胞在p53失活的CSCs附近积聚

研究表明，IL-34在Trp53缺失（Trp53^null）肝癌中促进了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的富集和促肿瘤极化。通过CIBERSORT分析，发现IL-34的表达与巨噬细胞比例正相关。单细胞RNA测序和流式细胞术结果显示，Trp53^null肿瘤中巨噬细胞和单核细胞的浸润显著增加，且这些巨噬细胞多数来自单核细胞，而非Kupffer 细胞。空间转录组学和免疫组织化学进一步证实，IL-34分泌的癌症干细胞（CSC）附近聚集了大量巨噬细胞。在Trp53^null肿瘤中的TAM表现出泡沫细胞特征和M2型巨噬细胞的标志物表达增加，并且这些TAM富集了促进脂质滴形成的基因。培养实验表明，Trp53^-/-肿瘤细胞能促进BMDM的脂质积累和促肿瘤极化，而这个过程依赖于IL-34的存在。这些结果表明IL-34在Trp53^null肿瘤中通过促进脂质积累和M2型极化，增强了TAM的促肿瘤功能。

研究成果四

IL-34通过CD36促进脂肪酸摄取并诱导巨噬细胞促肿瘤极化的代谢重编程

IL-34通过促进CD36的表达来增加TAMs中的脂质积累。使用脂肪酸探针BODIPY FL C₁₂测定发现，暴露于IL-34之后的BMDMs中脂肪酸摄取显著增加。RNA-seq和qPCR分析显示，暴露于IL-34后的BMDMs中CD36的表达水平升高。CD36抑制剂SSO或CD36抗体预处理的BMDMs在IL-34暴露后脂质积累未增加，表明CD36是脂肪酸积累的关键。

此外，IL-34通过上调PPAR-γ信号促进CD36的表达，PPAR-γ抑制剂T0070907预处理后，IL-34无法增加CD36的表达。IL-34还通过代谢重编程促进M2样巨噬细胞极化，GSEA分析表明暴露于IL-34的BMDMs中FAO基因富集并上调。Seahorse分析显示，IL-34增加了BMDMs的氧气消耗，这种增加被FAO酶CPT1抑制剂阻断，并且BMDMs展示了增加的线粒体膜电位。然而，Cd36沉默的RAW264.7细胞暴露于IL-34并未导致氧气消耗增加和M2样巨噬细胞极化。预处理BMDMs用SSO或etomoxir后，IL-34也未能促进M2样巨噬细胞极化。这表明CD36和FAO是IL-34诱导的巨噬细胞极化的关键成分。提出IL-34-CD36轴线负责泡沫状促肿瘤TAMs的形成。

研究成果五

IL-34 协调 CD36 介导的代谢重编程，驱动 Trp53null缺失肿瘤中 TAMs 的促肿瘤极化

研究IL-34-CD36轴在Trp53^null肿瘤中的作用，特别是在泡沫状促肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中的表现。首先，骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）与Trp53^+/+或Trp53^-/-肿瘤细胞共培养。结果显示，与Trp53^-/-肿瘤细胞共培养的BMDMs表现出更高的CD36和脂肪酸氧化（FAO）基因Cpt1a的表达，而在Trp53^-/-肿瘤细胞中敲除Il34基因消除了这种增加。这表明Trp53^-/-肿瘤细胞分泌的IL-34可以诱导巨噬细胞中的CD36表达和FAO。通过重新分析Trp53^null肝肿瘤的snRNA-seq数据，我们发现MDMs中Cd36的表达最高，并且KEGG分析显示这些细胞富集了脂肪酸代谢相关通路和PPAR信号通路，这些通路正向调节CD36表达。流式细胞术分析和多重免疫组化染色进一步确认，Trp53^null肝肿瘤中的TAMs表现出更高的CD36表达水平。这些结果表明IL-34通过CD36介导的脂肪酸代谢变化，推动了泡沫状巨噬细胞向M2样巨噬细胞的极化。为了验证IL-34-CD36轴在体内的作用，我们进行了Il34过表达和敲除实验。发现Il34过表达的肿瘤TAMs比例更高，且增加了CD36和CD206的表达及脂质含量。同时，在PT肿瘤中敲除Il34或在TAMs中条件性敲除Cd36均导致TAMs浸润减少，并且CD36、CD206表达及脂质含量降低。这证明IL-34-CD36轴在促进Trp53^null肿瘤中泡沫状巨噬细胞向M2样巨噬细胞极化中起关键作用。

研究成果六

IL-34调控的TMA抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫反应以促进肿瘤免疫逃逸

基因缺失Il34显著抑制了小鼠PT肿瘤的生长，但通过系统性消耗巨噬细胞后，这种抑制作用消失，表明IL-34协调的TAMs在肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。进一步分析显示，Trp53^null肿瘤中的T细胞比Trp53^WT肿瘤中的T细胞表现出更高的耗竭标志物表达，且其CD8⁺ T细胞产生的IFN-γ和TNF-α较少。此外，Trp53^null肿瘤中的TAMs在体外实验中对T细胞增殖和IFN-γ产生的抑制能力更强。通过共培养实验，我们发现PT细胞诱导的BMDMs显著抑制T细胞增殖和IFN-γ产生，但这种抑制作用在Il34基因缺失的情况下消失。进一步实验证实，巨噬细胞中Cd36的沉默也消除了T细胞增殖和IFN-γ产生的减少，支持IL-34-CD36轴在TAMs抑制T细胞介导抗肿瘤免疫中的作用。在体内实验中，Il34基因缺失和TAMs中Cd36条件性基因缺失均导致肿瘤浸润T细胞增加，并抑制PT肿瘤生长。然而，当小鼠接受CD8抗体注射时，IL-34缺失型PT肿瘤和对照PT肿瘤的生长差异消失。这些数据共同表明，IL-34-CD36轴协调的TAMs通过抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫来促进Trp53^null肝癌的肿瘤免疫逃逸。

研究成果七

阻断IL-34信号通路可作为治疗TP53突变癌症的潜在免疫疗法

基于IL-34-CD36轴在促进Trp53^null肝肿瘤免疫逃逸中的作用，研究表明阻断该轴可以有效抑制肿瘤生长。对携带Trp53/ PT肿瘤的小鼠进行IL-34或CD36中和抗体治疗，显著限制了肿瘤生长，并减少了单核细胞和TAMs的比例及其脂质含量和CD206表达。此外，阻断IL-34或CD36增加了T细胞浸润及其产生IFN-γ和TNF-α的比例。联合抗IL-34和抗CD36治疗进一步增强了肿瘤生长的抑制效果，并延长了小鼠的存活时间。虽然Trp53/PT肿瘤对抗PD-1治疗没有反应，但Il34基因缺失与抗PD-1治疗联合使用显著抑制了肿瘤生长，导致大部分病例完全响应，并赋予了长期免疫力。抗IL-34、抗CD36和抗PD-1的联合治疗有效阻止了Trp53^null肿瘤的发展，即使在已建立的较大肿瘤中也引起了强烈的生长限制。

在人类TP53突变的肝癌中，IL-34的表达显著上调，并且与较低的总体生存率相关。此外，TP53突变的肝癌中巨噬细胞浸润程度更高，IL34表达与巨噬细胞的浸润丰度以及CD36、TGFB1和CCL2的表达呈正相关。因此，研究表明阻断IL-34信号可能成为TP53突变癌症患者的潜在免疫治疗策略。

总结

该研究揭示了p53失活通过IL-34调控肿瘤相关巨噬细胞在肿瘤免疫逃逸中的关键作用，阐明了p53突变如何影响肿瘤免疫微环境的形成机制。这一发现不仅深化了我们对p53与肿瘤免疫逃逸关系的理解，还为开发靶向IL-34或CD36的免疫治疗策略提供了理论依据。